之前的幾期課堂講座給大家分享了ELISA實(shí)驗(yàn)的原理，操作步驟以及實(shí)驗(yàn)中的常見(jiàn)問(wèn)題（感興趣的小伙伴可以去視頻專區(qū)收看），近期又收到部分小伙伴的反饋問(wèn)題，主要集中在數(shù)據(jù)處理上。小編看了也覺(jué)得比較可惜，整個(gè)ELISA實(shí)驗(yàn)做得不錯(cuò)，可惜在后的數(shù)據(jù)處理上犯了錯(cuò)誤，直接導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出了大問(wèn)題，可謂功虧一簣。接下跟著小編進(jìn)行一次實(shí)戰(zhàn)案例的分析，詳細(xì)了解一下愛(ài)必信ELISA試劑盒的數(shù)據(jù)處理過(guò)程吧~

話不多說(shuō)，先上圖：

圖一. 客戶提供原始OD值圖（涉及未發(fā)表數(shù)據(jù)，部分隱去，部分略作處理）

圖二. 客戶處理的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
 

客戶反饋，部分?jǐn)?shù)據(jù)OD出現(xiàn)負(fù)值，無(wú)法處理，覺(jué)得試劑盒有問(wèn)題。小編接到這個(gè)case之后，簡(jiǎn)單的看了一下客戶的數(shù)據(jù)，就發(fā)現(xiàn)幾個(gè)明顯的數(shù)據(jù)處理問(wèn)題，而根據(jù)客戶的原始OD數(shù)據(jù)，初步判斷，試劑盒是正常的，并且實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還比較可靠。不知道是否有聰明的小伙伴已經(jīng)從這個(gè)數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了問(wèn)題呢？沒(méi)關(guān)系，跟著小編一起來(lái)抽絲剝繭的詳細(xì)分析一下吧~
 

1. OD值出現(xiàn)負(fù)值

大量樣品孔的讀值為負(fù)數(shù)，但接近零點(diǎn)，小編看了一下客戶標(biāo)曲的0點(diǎn)OD值接近0，初步判斷客戶是用空白孔進(jìn)行校準(zhǔn)，但空白孔由于操作污染等原因，OD值偏高，進(jìn)而導(dǎo)致樣品孔OD值為負(fù)。跟客戶溝通之后，確實(shí)是進(jìn)行了空白孔校準(zhǔn)。

溝通之后，確認(rèn)原始空白孔讀值為0.0962，明顯偏高，正常OD450的空白孔讀值應(yīng)為0.06左右。

在這里，小編建議有條件的小伙伴，盡量要用我們推薦的雙波長(zhǎng)校正法，使用570或630nm波長(zhǎng)進(jìn)行校正，OD450 - OD570/630即為校正后的OD值，可直接用于計(jì)算，也可根據(jù)數(shù)據(jù)質(zhì)量，再進(jìn)行空白校正。如沒(méi)有雙波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀，讀取OD450數(shù)據(jù)后，應(yīng)先判斷數(shù)據(jù)質(zhì)量，再進(jìn)行空白校正。
 

小編將空白校正進(jìn)行補(bǔ)回，得到的OD450原始數(shù)據(jù)如下：至此，樣品孔數(shù)據(jù)出現(xiàn)負(fù)值這一問(wèn)題解決。

圖三. 經(jīng)還原處理的OD450原始數(shù)據(jù)圖

2. 標(biāo)曲擬合問(wèn)題

處理完了負(fù)值問(wèn)題，還有一個(gè)很明顯的問(wèn)題就是，客戶的標(biāo)曲擬合問(wèn)題。我們這款試劑盒（Mouse TNF alpha ELISA Kit，abs520010）標(biāo)曲高點(diǎn)是2000 pg/ml，客戶給我的截圖（圖二）只到250 pg/ml，再仔細(xì)研究一下，發(fā)現(xiàn)客戶的擬合方式用的竟然是直線擬合。跟客戶溝通之后，確認(rèn)原因，客戶選擇直線擬合，高點(diǎn)不符合擬合方式，R2值過(guò)低，所以客戶自己把上面高濃度的點(diǎn)去掉了，只選取到250 pg/ml，進(jìn)行直線擬合。在這里，小編強(qiáng)調(diào)一下， 愛(ài)必信ELISA試劑盒推薦擬合方式為四參數(shù)擬合，四參數(shù)擬合，四參數(shù)擬合，重要的事情說(shuō)三遍。不要再用其他稀奇古怪的擬合方式進(jìn)行擬合啦。就像這個(gè)客戶犯的錯(cuò)誤，雖然看似250 pg/ml以下的點(diǎn)可以用直線擬合，但是表達(dá)含量較高的樣品，OD值高時(shí)，就不符合他擬合的這條直線了，會(huì)導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)嚴(yán)重偏差。由于0孔出現(xiàn)問(wèn)題，小編在擬合標(biāo)曲時(shí)，將OD值低的孔作為空白孔，TNF-α在正常樣品中表達(dá)含量極低，可視為0，擬合曲線如下：

圖四. 四參數(shù)擬合的曲線圖及方程
 

回歸計(jì)算之后得到樣品濃度，部分無(wú)法計(jì)算出的樣品孔，表達(dá)含量低于0點(diǎn)，按0計(jì)算即可。

本期ELISA實(shí)戰(zhàn)案例解析就到這里了，希望對(duì)各位小伙伴們有所幫助。大家在平時(shí)的實(shí)驗(yàn)中遇到什么問(wèn)題也可以聯(lián)系我們，小編匯總之后，盡力為大家解答~

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