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DNA純化——PCR產(chǎn)物純化

更新時間:2021-11-10      點擊次數(shù):2524

一、產(chǎn)物直接純化

PCR擴增完成后需要進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,在條帶單一無其他雜帶的情況下,可以直接對產(chǎn)物進行純化,常見的純化方法有:

 

1、硅膠層析柱法

原理:大多數(shù)離心柱中吸附DNA的是一層硅膠膜,實際上就是一層玻璃纖維,其表面有大量修飾的硅羥基(Si-OH),硅羥基在溶液中解離后帶負電,然后與帶正電鹽離子、帶負電DNA形成電橋,從而吸附住DNA,使得DNA雙鏈變單鏈,不會被生物大分子溶劑洗脫,但能經(jīng)水溶性緩沖液水化后,被定量回收,從而實現(xiàn)純化分離。

 

圖1 硅膠層析原理示意圖

 圖2 硅膠層析流程簡圖

 

2、磁珠法(abs60151)

原理:磁珠是有磁性的能吸附DNA的物質,其內部核心是鐵離子,在磁場作用下可以吸附在磁體上。在核心外,經(jīng)過羧化,帶有羧基基團,在特定的離子條件下,可以與DNA結合。結合后,在外磁場的作用下,磁珠與DNA結合體移動到磁體周圍,可以很方便去除其他多余的液體,這時,不能與磁珠結合的所有雜質都隨水溶液一并去除。然后,在洗脫條件下,DNA與磁珠分離,溶解在水中,將溶解有DNA的溶液轉移,就得到了純化后的DNA樣本。

 

圖3 磁珠法結構示意圖

 圖4 磁珠法純化DNA流程簡圖

 

3、其他純化方法

①滲透液結合醇沉純化

原理:利用分子大小不同,小分子的物質能夠通過滲透膜溶解到大量的溶液中去,而大分子的物質不能通過滲透膜,所以繼續(xù)留存在透析袋中,通過乙醇沉淀最后達到去除小分子物質,得到純化的有機大分子的效果。

②直接沉淀純化

原理:DNA分子在高鹽離子醇溶液中會被沉淀出來,而其他物質繼續(xù)溶液在溶液中,沉淀出來的DNA分子經(jīng)過離心與溶液成分分開,達到純化的目的。
 

不同純化方法對比

純化方法

硅膠層析柱法

磁珠法

滲透液純化

沉淀純化

純化介質

硅膠膜

磁珠

滲透膜

乙醇/異丙醇

優(yōu)勢

操作簡便、快速、安全,產(chǎn)物純度高隨時用于下游實驗

產(chǎn)物純度高;通量高,可實現(xiàn)自動化;操作簡便、快速、安全;高靈敏度

樣本處理體積靈活,產(chǎn)量高,成本低

劣勢

存在堵柱風險;對樣本起始量有限制;難以實現(xiàn)自動化操作,大批量處理費時費力;小于100bp的DNA段難以吸附

需要搭配磁力架或者儀器使用,成本較高;部分DNA難以被抓取導致回收率低;小于100bp的DNA段難以吸附

安全性低,無法進行高通量提取、純度較低

選擇依據(jù)

樣本起始量較充足,但數(shù)量不多,需要操作簡便省時,且提取出的DNA能用于絕大多數(shù)下游實驗的實驗室

下游需要高純度的DNA,需要大批量處理,能夠支持自動化提取的實驗室

時間充足,樣本量充足,想節(jié)省成本的實驗室

 

二、凝膠回收純化

如電泳檢測結果存在非特異性條帶,則需要將目的條帶切出來,再用膠回收試劑盒(abs60098)對凝膠進行回收純化,相較于直接純化,只是多了一步溶膠的過程,相應的產(chǎn)物純度提高,回收率則下降。

 

結語:

在PCR擴增完成后,反應體系中除了DNA段,還存在離子、dNTP、引物及聚合酶等物質,這些物質會影響后續(xù)克隆測序等實驗,因此對其產(chǎn)物進行純化是必*步驟,不同的純化手段各有自己的優(yōu)缺點,老師們可以根據(jù)自己的需求選擇適合自己的方法。

 Absin相關產(chǎn)品推薦

貨號名稱
abs60151磁珠法PCR產(chǎn)物回收試劑盒
abs60098DNA Gel/PCR Purification Kit
abs798210孔磁力架
abs798120孔磁力架
abs79832孔磁力架
abs7980多功能孔磁力架

 

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WB相關:ECL發(fā)光液、預染marker、預制膠;IHC相關:二抗試劑盒、組化筆;IP/CoIP試劑盒;激動劑/抑制劑;血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE;凋亡試劑盒;呼吸爆發(fā)試劑盒;ELISA試劑盒;重組蛋白;抗體: 二抗、標簽抗體、對照抗體;定制服務(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...

 

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